Hija de Juana de Portugal y Enrique IV, su nacimiento abrió una brecha entre el rey y sus hermanos Isabel y Alfonso por las aspiraciones a la corona.

Nació, de difícil parto, del vientre de Juana de Avis y legalmente tuvo como padre a Enrique IV, aunque fue apodada la Beltraneja por los rumores existente de que su padre pudo ser el valido Beltran de la Cueva. Para muchos era la heredera legal de la Corona, aunque una parte de la nobleza castellana no la aceptó como hija biológica del rey.

Se dijo que Enrique IV, llamado el impotente, había obligado a su mujer a tener un hijo con Beltrán de la Cueva, su favorito, aunque ambos juraron solemnemente que no había sido así.

Juana fue bautizada e Isabel la Católica fue su madrina y Juan Pacheco su padrino. Precisamente ambos jugaron un papel determinante en contra de Juana a lo largo de su vida. Pocos meses después fue jurada en las Cortes de Madrid como princesa de Asturias y heredera del reino, aunque Juan Pacheco ya entonces renegó de su juramento ante un notario.